Carte protéique spatialement résolue des virions intacts du cytomégalovirus humain

Nature Microbiology volume 8, pages 1732-1747 (2023)Citer cet article

2389 Accès

80 Altmétrique

Détails des métriques

Les herpèsvirus assemblent de grosses particules enveloppées qui sont difficiles à caractériser structurellement en raison de leur taille, de leur fragilité et de leur protéome multicouche complexe de nature partiellement amorphe. Ici, nous avons utilisé la spectrométrie de masse de réticulation et la protéomique quantitative pour dériver une carte d'interactome résolue spatialement de virions de cytomégalovirus humain intacts. Cela a permis l’allocation de novo de 32 protéines virales en quatre couches de virions spatialement résolues, chacune organisée par une protéine d’échafaudage viral dominante. La protéine virale UL32 s'engage dans toutes les couches dans une orientation radiale N-vers-C-terminale, reliant la nucléocapside à l'enveloppe virale. Nous avons observé l'incorporation spécifique à la couche de 82 protéines hôtes, dont 39 sont recrutées sélectivement. Nous avons découvert comment UL32, par recrutement de la PP-1 phosphatase, s'oppose à la liaison aux protéines 14-3-3. Ce mécanisme assure une biogenèse virale efficace, suggérant un rôle perturbateur de l'interaction UL32-14-3-3. Enfin, nous avons intégré ces données dans un modèle à gros grains pour fournir des informations globales sur la configuration native des interactions entre le virus et la protéine hôte au sein des virions de l'herpès.

L’assemblage structuré de particules infectieuses, appelés virions, est fondamental pour la transmission du virus entre cellules et organismes. Les virions contiennent le génome de l'acide nucléique viral enfermé dans une coque protéique de capside. Un certain nombre de protéines co-emballées facilitent le processus d’infection et le début de l’expression des gènes viraux. Les herpèsvirus, une famille de virus à ADN double brin, assemblent des particules particulièrement grosses et complexes, abritant de nombreuses protéines différentes qui sont délivrées à la cellule hôte lors de l'infection.

La capacité des virions de l’herpès à incorporer un large éventail de protéines est rendue possible par leur architecture multicouche typique1. L'enveloppe lipidique externe héberge diverses glycoprotéines virales nécessaires à la liaison des récepteurs de la cellule hôte et à la fusion membranaire2. L'espace entre l'enveloppe et la nucléocapside icosaédrique centrale est rempli d'une matrice protéique, le tégument. Bien que les protéines tégumentaires individuelles aient été attribuées à des sous-couches internes et externes distinctes sur la base de données biochimiques et microscopiques 4,5, les détails de l'organisation des protéines tégumentaires ne sont pas compris. Les particules d’herpèsvirus incorporent également de nombreuses protéines hôtes, mais très peu de ces événements ont été caractérisés fonctionnellement ou mécanistiquement6,7.

Des études récentes en microscopie électronique cryogénique (cryoEM) des virions de l'herpès ont révélé des sous-structures de la nucléocapside8,9, du portail10,11 et de plusieurs complexes glycoprotéiques2,12,13. De plus, des études antérieures n’ont fourni qu’un aperçu de la composition protéique globale des virions de l’herpès, identifiant entre 46 et 82 protéines virales14,15,16,17,18. Cependant, une caractérisation systématique de la coordination spatiale et des interactions des protéines virales et hôtes au sein des virions fait défaut.

Ici, nous utilisons la spectrométrie de masse de réticulation (XL – MS) pour construire une carte de proximité à l'échelle du virion de 32 protéines virales et 82 protéines hôtes dans des virions extracellulaires intacts du cytomégalovirus humain (HCMV), le plus grand virus de l'herpès humain. Les données permettent l’attribution de novo des protéines de l’hôte et du virus et de leurs interactions protéine-protéine (IPP) aux couches de virions, fournissant ainsi un aperçu de l’organisation des sous-couches tégumentaires. Nous constatons que la protéine virale UL32 (également connue sous le nom de pp150) agit comme un échafaudage dominant, s'engage dans les IPP à travers la particule et négocie le recrutement de protéines hôtes, telles que les protéines 14-3-3 et la protéine phosphatase 1 (PP-1) . PP-1 s'oppose à la liaison du 14-3-3 à l'UL32 et est nécessaire au démarrage efficace de l'expression des gènes viraux et à la production de descendance virale. Ainsi, en cartographiant l’organisation du protéome au sein des herpèsvirions natifs, nous fournissons une base pour la compréhension structurelle et fonctionnelle des IPP cruciaux.

0.75 in n = 2 biological replicates) in virions (bottom bar). d,e, Purified virions from recombinant mutant viruses harbouring alanine substitutions in the designated motifs were assessed for protein levels by immunoblotting. Representative experiments of n = 2 biological replicates are shown./p>91% of the protein copies inside a virus particle./p>

10 copies) be identified in both replicates. When a crosslink involved a lower-abundance protein (that is, <10 copies), we required that the crosslink be identified in only one of the replicates. The rationale is that this balances crosslink confidence for highly abundant proteins with sensitivity for low-abundance proteins. Second, PPIs were only reported when there were two unique crosslinks identified, giving a higher-confidence set of PPIs. To retain only host proteins incorporated into the particle, host proteins that did not directly link to viral proteins were removed. The filtered set of crosslinks is available in Supplementary Table 2. The list of the corresponding PPIs together with evidence from existing data is available in Supplementary Table 3. The XL-based PPI network was generated on the basis of interprotein crosslinks from Supplementary Table 2 and visualized using edge-weighted spring-embedded layout70 in Cytoscape v.3.7.2. Edge weighting was based on the number of identified interlinks between protein pairs. Additional crosslink networks between selected proteins were visualized using xiNET71./p>

0.75 were considered (from the Phospho (STY).txt table). The positions of individual phosphosites as identified from this experiment were used to map phosphosites on the UL32 amino acid sequence (Fig. 4c). Phosphosite SILAC ratios were also corrected for the protein-level SILAC ratios (from proteinGroups.txt) as quantified from an analysis of the whole-virion proteome without IMAC enrichment. Phosphosites were excluded when the corresponding phosphopeptide contained residues mutated in the SILK/RVxF motifs of UL32. Then, protein-level corrected phosphosite ratios were averaged (quantification in both replicates required)./p>0.6 were considered./p>

220 nm). These correspond to the median of diameters from the purified sample ± two times the standard deviation. The fraction of particles with diameters that fall below 160 nm, exceed 220 nm or fall in between are indicated for the non-cross-linked (d) or cross-linked (e) sample types. Purification results in more homogeneous particle diameters, enriching virions in the expected size range. Thus, our protocol captures the native configuration of the particles at relatively high sample purity. At least 367 particles were counted per condition./p>