Un pipeline de découverte d’anticorps bispécifiques à haut débit

Biologie des communications volume 6, Numéro d'article : 380 (2023) Citer cet article

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Les anticorps bispécifiques (BsAbs) représentent une classe émergente d’immunothérapie, mais l’inefficacité de la découverte actuelle a limité leur large disponibilité clinique. Nous rapportons ici un pipeline de criblage fonctionnel agnostique à haut débit, basé sur une seule cellule, comprenant l'ingénierie moléculaire et cellulaire pour une génération efficace de cellules de bibliothèque BsAb, suivie d'une interrogation fonctionnelle au niveau d'une seule cellule pour identifier et trier les clones positifs et la séquence en aval. identification et caractérisation des fonctionnalités. En utilisant un engageur de cellules T bispécifiques CD19xCD3 (BiTE) comme modèle, nous démontrons que notre plate-forme unicellulaire possède une efficacité de criblage à haut débit allant jusqu'à un million et demi de cellules de bibliothèque de variantes par analyse et peut isoler des clones fonctionnels rares à un faible abondance de 0,008%. En utilisant une bibliothèque de cellules complexe exprimant CD19xCD3 BiTE avec environ 22 300 variantes uniques comprenant des scFv variés de manière combinatoire, des lieurs de connexion et des orientations VL/VH, nous avons identifié 98 clones uniques, dont des clones extrêmement rares (abondance d'environ 0,001 %). Nous avons également découvert des BiTE qui présentent de nouvelles propriétés et informations permettant de concevoir des préférences variables en matière de fonctionnalité. Nous espérons que notre plateforme unicellulaire augmentera non seulement l’efficacité de la découverte de nouveaux produits immunothérapeutiques, mais permettra également d’identifier des principes de conception généralisables basés sur une compréhension approfondie des interrelations entre la séquence, la structure et la fonction.

Les anticorps bispécifiques (BsAbs) représentent une classe très attractive d’anticorps et de produits immunothérapeutiques qui recèlent un grand potentiel pour traiter de nombreux troubles, notamment le cancer et l’auto-immunité1,2,3,4,5. Ce sont des produits biologiques non naturels conçus pour reconnaître deux épitopes différents sur le même antigène cible ou sur des antigènes différents. Les BsAb offrent des modes d'action thérapeutiques uniques, tels que l'activation et l'engagement des cellules immunitaires pour tuer les cellules tumorales et l'action simultanée sur deux cibles thérapeutiques en synergie5,6,7,8. Par conséquent, les BsAb peuvent présenter des avantages thérapeutiques supérieurs par rapport aux anticorps monoclonaux (mAb) traditionnels en ce qui concerne la spécificité, l’efficacité, la toxicité et la résistance aux médicaments. Les BsAb activant les lymphocytes T (TAB) représentent la plus grande sous-classe d'Abs Bs et représentent plus de 50 % du pipeline préclinique et clinique d'Abs Bs9, y compris le Blinatumomab (CD3xCD19), le Tebentafusp-tebn (CD3xGP100), le Mosunetuzumab (CD3xCD20) et le Teclistamab cliniquement approuvés ( CD3xBCMA)9,10. Les TAB peuvent relier directement les cellules T et les cellules tumorales pour les tuer et ont un grand potentiel pour traiter de nombreux types de cancer. Il existe actuellement plus de 45 TAB basés sur CD3, dont BCMAxCD3, Her2xCD3, CEAxCD3 et PSMAxCD3, en cours de test clinique pour le traitement des cancers solides et hématologiques1,6. Les TAB peuvent être conçus dans plusieurs formats, y compris les activateurs de cellules T bispécifiques (BiTE), qui utilisent des fragments variables de fragments à chaîne unique (scFv) liés en tandem ciblant un épitope de cellule T et un antigène tumoral et une IgG à chaîne légère commune avec une taille réelle. configuration d'immunoglobuline où chaque chaîne lourde variable cible soit un récepteur de lymphocytes T, soit un antigène tumoral1,6.

Malheureusement, le développement de BsAb thérapeutiques, y compris les TAB, reste un processus extrêmement difficile, lent et coûteux, limitant leur disponibilité clinique pour un large éventail de maladies. Nous attribuons ce goulot d'étranglement en grande partie à la complexité et à l'inefficacité des méthodes actuelles de découverte de BsAb. Le flux de travail conventionnel pour la découverte de BsAb commence généralement par la caractérisation d’un pool de liants de mAb pour deux antigènes ou épitopes respectifs. Ensuite, un panel d'AcM est sélectionné pour concevoir individuellement des variants de BsAb en joignant deux domaines de liaison à l'antigène dérivés de chaque mAb parental via une hétérodimérisation de sous-unités ou une fusion génétique directe (par exemple, BiTE)11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23. Ensuite, un nombre limité de variants de BsAb sont exprimés, purifiés et ensuite testés individuellement dans un test de liaison à double cible et/ou un test fonctionnel pour identifier les clones positifs. Il convient de noter que, bien que la construction de BsAb commence généralement avec deux liants d’antigènes pré-caractérisés, leur intégration pour devenir un BsAb fonctionnel est beaucoup moins simple. En effet, l’activité de liaison d’un BsAb à ses cibles n’est qu’un prérequis, qui ne se traduit pas toujours en activité fonctionnelle. Par exemple, l'Emicizumab (un BsAb cliniquement approuvé pour traiter l'hémophilie A) a été découvert par une approche « par force brute » dans laquelle environ 40 000 candidats ont dû être exprimés, caractérisés et optimisés individuellement11. Pour les TAB, en particulier, l'activation des lymphocytes T et les fonctions de destruction des tumeurs des BsAb résultants dépendent de manière cruciale de nombreux facteurs, notamment l'emplacement de l'épitope et la distance par rapport à la membrane cellulaire24,25,26,27,28,29, la taille et la densité de l'antigène27,28,29. ,30,31,32,33,34,35,36, affinité de liaison anticorps/antigène31,32,33,34,35,37,38, taille, valence, repliement, orientation structurelle et mécanique des BsAb, ainsi que longueur du lieur et flexibilité27,36,39,40,41,42. Bien qu'il soit bien reconnu que de petites variations dans les formats et les caractéristiques des BsAb peuvent être des déterminants essentiels de la fonctionnalité, les relations entre ces facteurs sont compliquées et, à l'heure actuelle, il n'existe aucun principe de conception général pouvant éclairer la fonction des BsAb. En pratique, le domaine s'appuie donc sur un processus d'essais et d'erreurs dans lequel les BsAb sont conçus et construits de manière empirique à partir de liants de mAb existants et doivent ensuite être évalués individuellement pour leur fonctionnalité. Cette approche conventionnelle, impliquant généralement une plaque de microtitration et un système de manipulation de liquides, est biaisée et limite considérablement le débit de découverte, le taux de réussite et le délai d'exécution pour identifier une piste thérapeutique pour un développement ultérieur.